学校的网站管理系统,做百科需要发哪些网站,经典网络营销案例,网站使用的数据库主要有哪些今天给同学们分享一篇实验文章“CD8 T cells maintain killing of MHC-I-negative tumor cells through the NKG2D-NKG2DL axis”#xff0c;这篇文章发表在Nat Cancer期刊上#xff0c;影响因子为22.7。 结果解读#xff1a;
MHC-I阴性肿瘤的免疫疗法需要CD8 T细胞
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今天给同学们分享一篇实验文章“CD8 T cells maintain killing of MHC-I-negative tumor cells through the NKG2D-NKG2DL axis”这篇文章发表在Nat Cancer期刊上影响因子为22.7。 结果解读
MHC-I阴性肿瘤的免疫疗法需要CD8 T细胞
作者先前已经证明了4-1BB激动和抗程序性细胞死亡蛋白1PD-1检查点阻断αPD-1/4-1BB在小鼠CT2A胶质瘤模型中的疗效。毫不奇怪这种疗效依赖于CD8 T细胞的存在。最近为了研究抗原特异性反应作者将CT2A小鼠胶质瘤细胞系改造成表达酪氨酸酶相关肽2TRP2的CT2A-TRP2细胞系这是一个免疫原性较弱的模型抗原。αPD-1/4-1BB联合治疗对原位植入的CT2A-TRP2肿瘤表现出类似的疗效导致80%的长期生存图1a。 最初的目的是研究肿瘤抗原呈递对肿瘤微环境的影响作者使用CRISPR技术在CT2A-TRP2细胞系中敲除KO编码β2m的基因生成CT2A-TRP2-β2mKO细胞系图1b。流式细胞术检测结果显示CT2A-TRP2-β2mKO细胞缺乏MHC-I表达H2K和H2D图2。通过干扰素IFN-γ刺激实验进一步确认了MHC-I的敲除。IFN-γ刺激导致亲本CT2A-TRP2细胞中H2K和H2D的上调但CT2A-TRP2-β2mKO细胞中未见上调图3。此外TRP2 TCR转导的CD8 T细胞TRP2 T细胞未能在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤但能有效杀死亲本CT2A-TRP2肿瘤从而对CT2A-TRP2-β2mKO细胞系中MHC-I的敲除进行了功能验证图4。
令人惊讶的是作者发现携带颅内i.c.CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的小鼠对免疫疗法仍然有反应对αPD-1/4-1BB联合治疗表现出100%的长期生存率对抗4-1BB单独治疗表现出90%的长期生存率图1e。与CT2A-TRP2肿瘤一样未经治疗的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤是致命的。对CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的免疫治疗效果不仅限于颅内区域αPD-1/4-1BB在皮下植入的MHC-I阴性胶质瘤中仍然有效图1f。此外αPD-1/4-1BB对缺乏MHC-I的原位植入黑色素瘤B16-F10-OVA-β2mKO以下简称B16-OVA-β2mKO仍然有效图1g。最终MHC-I阴性肿瘤的免疫治疗成功既不局限于胶质瘤也不局限于颅内区域。
被激发了兴趣作者试图确定免疫细胞群体对MHC-I阴性肿瘤免疫疗法的疗效负责。由于已知NK细胞能够消除缺失或减少MHC的细胞作者首先在植入CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤之前通过消耗NK细胞进行了调查扩展数据图1b。即使没有NK细胞αPD-1/4-1BB仍然能够引发100%的长期生存图1h。因此作者进一步探讨了免疫治疗对CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的疗效是否仍然依赖于CD8 T细胞即使肿瘤没有MHC-I表达。消耗CD8 T细胞扩展数据图1c完全取消了αPD-1/4-1BB对携带CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的小鼠的生存益处。这一点在肿瘤植入之前扩展数据图1d或肿瘤植入后早期第3天或晚期第7天时间点图1ij消耗CD8 T细胞都是成立的。值得注意的是CD4 T细胞的消耗对生存率有一定但不显著的影响扩展数据图1ef。 特异性抗原杀伤在MHC-I阴性肿瘤中持续存在
继续依赖CD8 T细胞引发了一个问题即是否还以特异性抗原的方式对MHC-I阴性肿瘤进行细胞毒杀。有趣的是作者注意到αPD-1/4-1BB治疗的MHC-I阴性CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的小鼠体内TRP2特异性CD8 T细胞的数量比同样接受治疗的MHC-I阳性CT2A-TRP2肿瘤的小鼠体内更多图2a和扩展数据图2a。为了测试抗原特异性的作用作者将CT2A-TRP2-β2mKO或CT2A-β2mKO肿瘤缺乏TRP2和MHC-I表达植入缺乏CD8 T细胞CD8KO的小鼠的脑内。随后小鼠接受TRP2特异性CD8 T细胞的移植TRP2 ALT产生一个完全特异于TRP2的T细胞组分图2b。TRP2 ALT与αPD-1/4-1BB联合治疗足以消除100%的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤图2c但对缺乏TRP2表达的CT2A-β2mKO肿瘤则完全无效图2d。此外作者将CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤植入转基因OT-1小鼠的脑内。这些小鼠中的大多数T细胞识别卵清蛋白OVA肽段OVA 257–264 SIINFEKL的残基257-264但对TRP2没有反应。在这些小鼠中αPD-1/4-1BB的组合对CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤完全无效图2e进一步表明即使在没有肿瘤MHC-I抗原呈递的情况下肿瘤特异性T细胞仍然是必需的。 上面作者证明了TRP2 T细胞无法在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞图1d这证实了单独的CD8 T细胞无法杀死MHC-I阴性肿瘤即使存在相应的抗原。因此作者假设在体内观察到的细胞毒性必须由其他细胞群体协助。在体内浸润的髓系细胞构成了脑肿瘤微环境中的大部分免疫细胞。因此作者检查了是否添加骨髓源性巨噬细胞BMDMs可以让TRP2 T细胞在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤。CT2A-TRP2或CT2A-TRP2-β2mKO图3a肿瘤细胞与TRP2 T细胞一起培养同时加入TRP2肽负载的BMDMsTRP2巨噬细胞或未负载的BMDMs未负载巨噬细胞。虽然TRP2 T细胞单独但不是TRP2巨噬细胞能够有效杀死MHC-I阳性的CT2A-TRP2肿瘤但是TRP2 T细胞单独或TRP2巨噬细胞单独都无法杀死MHC-I阴性的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤。然而令人惊讶的是TRP2巨噬细胞和TRP2 T细胞的组合确实足以在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤。有趣的是未经脉冲处理的巨噬细胞与TRP2 T细胞的组合也未能导致对肿瘤细胞的显著杀伤这表明巨噬细胞与CD8 T细胞之间的抗原-同源相互作用对于对缺乏MHC-I的肿瘤细胞产生细胞毒性是必要的。虚假的TCR转导的CD8 T细胞无法杀死任何一种肿瘤细胞系即使在TRP2负载的巨噬细胞存在的情况下也是如此。重要的是作者使用OVA特异性OT-1 T细胞和OVA脉冲的巨噬细胞在另一种表达不同靶抗原OVA的小鼠胶质瘤细胞系GL261中重复了这些发现图3b-d。 CD8 T细胞通过直接接触杀死MHC-I阴性肿瘤
作者接下来研究了杀死缺乏MHC-I的肿瘤细胞的机制要求。首先确定是否涉及可溶性因子作者使用了0.4微米的Transwell板它允许细胞因子和其他可溶性介质自由通过但不允许细胞通过。将MHC-I阴性的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞放置在Transwell板的底部TRP2 T细胞和TRP2巨噬细胞的不同组合被添加到膜的同侧或对侧。将T细胞和/或巨噬细胞与肿瘤细胞物理分离消除了肿瘤杀伤活性表明需要直接细胞间接触而不是可溶性因子图4a。 然后作者调查了巨噬细胞或T细胞是否更直接地参与了接触依赖性肿瘤细胞毒杀机制。为了进行这些实验作者使用了5.0微米的Transwell板这样较小的T细胞可以通过到含有肿瘤细胞的孔底部而较大的巨噬细胞则无法通过验证见扩展数据图3a。CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞被放置在Transwell插入物的对面与T细胞和巨噬细胞隔开。这种设置允许T细胞首先与巨噬细胞直接接触然后通过膜与肿瘤细胞直接接触。在这种情况下肿瘤杀伤的程度与三种细胞类型都接触时没有显著差异图4a。这表明杀伤MHC-I阴性肿瘤需要肿瘤细胞与TCR刺激的T细胞直接接触而巨噬细胞只需要提供前驱抗原特异性T细胞刺激的角色。 NKG2D介导T细胞对MHC-I阴性肿瘤的识别
为了阐明CD8 T细胞识别MHC-I阴性肿瘤的细胞-细胞接触依赖机制的性质作者首先采用无偏方法研究了抗原特异性CD8 T细胞在暴露于MHC-I阴性肿瘤和相应抗原负载的巨噬细胞时的炎症基因表达谱的差异。将与OVA脉冲的巨噬细胞共培养的经过激活的OT-1 T细胞的基因集与仅与OVA阴性CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞共培养的经过激活的OT-1 T细胞进行比较。使用OVA阴性的β2mKO肿瘤细胞系以确保肿瘤-TCR相互作用的缺失。这些实验中的OT-1细胞的TCR激活是通过与OVA脉冲的巨噬细胞同时培养来完成的。接触CT2A-TRP2-β2mKO细胞的TCR激活的OT-1细胞表达了标志NK和T细胞功能的基因而仅仅是TCR激活的OT-1细胞没有这种增加图5a。在T细胞功能基因集中不同表达的基因包括编码激活标志的基因但不包括直接接触介导的细胞毒性的受体扩展数据图4a). 值得注意的是在凋亡基因集中Tnfsf10的表达略有增加该基因编码TNF相关凋亡诱导配体TRAILlog 2 折叠变化 0.562调整后的P值 0.0262扩展数据图 图4b。因此考虑到其在接触依赖性T细胞细胞毒性中的已知作用作者调查了TRAIL是否参与杀死体外MHC-I阴性肿瘤。然而阻断TRAIL并没有显著减少T细胞介导的体外细胞毒性无论是针对MHC-I阳性还是MHC-I阴性肿瘤扩展数据图 图4c。 在NK细胞功能基因集中Klrk1的表达在暴露于CT2A-TRP2-β2mKO细胞的OT-1细胞中特别突出图5blog折叠变化 1.1调整的P值 3.25×10。NKG2D是一个激活受体传统上与NK细胞的细胞毒功能相关尽管它也在活化的CD8 T细胞上表达其作用主要被描述为共刺激。在小鼠中NKG2D的配体是β2m非依赖的非经典MHC-I分子RAE-1、H60和MULT-1。与在所有有核细胞上表达的经典MHC-I不同非经典MHC-I的表达通常是由应激诱导的并且在肿瘤细胞上上调。已经显示肿瘤细胞上非经典MHC-I的表达在接受化疗或电离辐射后进一步上调。
同样地在TCR激活后NKG2D受体与靶细胞上的配体结合激活NKG2D细胞中的细胞毒性效应包括释放细胞毒性颗粒和表达Fas配体FasL。特别是在CD8 T细胞中NKG2D细胞效应似乎依赖于同时的TCR激活以将效应活性限制在适当的周围靶标上。在小鼠CD8 T细胞中NKG2D表达在TCR激活后上调扩展数据图4d。由于作者模型中CD8 T细胞介导的MHC-I阴性肿瘤杀伤也依赖于TCR激活但不需要T细胞与肿瘤细胞之间的抗原配对相互作用作者假设NKG2D可能是肿瘤杀伤机制的重要因素。为了初步评估这一点作者首先检查了模型中T细胞上的NKG2D表达。因此作者检查了未经处理的小鼠中浸润CT2A-TRP2或CT2A-TRP2-β2mKO胶质瘤的CD8 T细胞上NKG2D表达的差异以及经αPD-1/4-1BB治疗的小鼠中的差异。NKG2D水平在治疗的MHC-I阴性CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤浸润的CD8 T细胞上明显高于治疗的MHC-I阳性肿瘤或未经处理的肿瘤图5c。检测到T细胞上NKG2D水平的增加作者反过来检查了两种MHC-I阴性肿瘤系的相关NKG2DLs的存在。发现CT2A-TRP2-β2mKO系高度表达非经典MHC-I分子RAE-1和MULT-1这些发现在额外的胶质瘤系GL261-OVA-β2mKO中得到了重复扩展数据图4e,f。
为了研究NKG2D对CD8 T细胞对MHC-I阴性肿瘤的功能贡献作者重复了作者之前的体外肿瘤细胞毒杀实验这次在有或没有NKG2D阻断抗体的情况下进行。OT-1 T细胞再次与OVA阴性、MHC-I阴性的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞培养尽管在这些实验中作者使用CT2A-OVA细胞作为OVA抗原呈递和OT-1 TCR激活的来源。与作者之前的结果一样只有在有OVA呈递细胞的情况下OT-1 T细胞才能成功杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤图5d。然而在存在抗NKG2D阻断抗体的情况下对CT2A-TRP2-β2mKO细胞的杀伤完全被抑制图5d。使用CT2A-OVA肿瘤作为OVA TCR刺激的来源还使作者能够评估抗NKG2D治疗对MHC-I阳性肿瘤细胞的伴随杀伤的影响。在任何条件下CT2A-OVA细胞都能够被轻易杀死扩展数据图4g。 NKG2D信号传导的下游细胞毒性效应物可以包括颗粒酶、穿孔素和FasL2931这就提出了一个问题即在作者的系统中其中哪些可能介导MHC-I阴性肿瘤细胞的杀伤。作者的表达分析数据显示颗粒酶B和FasL表达增加扩展数据图4hi在暴露于MHC-i阴性肿瘤的TCR激活的T细胞中表明脱颗粒可能在抑瘤机制中发挥作用。事实上与单独的巨噬细胞相比在MHC-I阴性肿瘤细胞和携带同源抗原的巨噬细胞存在的情况下OT-1 T细胞的脱颗粒增加图5e。鉴于先前研究的结果32-34作者还专门测试了FasL-Fas相互作用的作用。肿瘤浸润性CD8T细胞上FasL的表达在免疫治疗的反应中增加但在从MHC-I阳性肿瘤和MHC-I阴性肿瘤中分离的CD8T淋巴细胞中没有显著差异扩展数据图4j–l。此外在体外抗原阴性Fas受体KOFasKO黑色素瘤仍然易被TCR激活的CD8T细胞杀死扩展数据图图5a表明FasL-Fas相互作用对肿瘤抑制机制并不重要。 总结
在这里作者描述了MHC-I和抗原非依赖性CD8T细胞杀伤肿瘤细胞的机制该机制在体内和人类肿瘤细胞中一致可见。作者证明CD8T细胞依赖性免疫疗法确实可以对肿瘤保持有效即使在完全缺乏MHC-I的情况下也是如此。需要进一步研究NKG2D和NKG2DL在介导肿瘤免疫治疗易感性中的作用以及这些发现的其他潜在治疗意义。对这篇文章的思路感兴趣的老师欢迎咨询
