做网站是用什么技术的,合作在惠州做网站,做网站竞品分析,电影网站规划今天给同学们分享一篇实验文章“Antisense oligonucleotide therapy for H3.3K27M diffuse midline glioma”#xff0c;这篇文章发表在Sci Transl Med期刊上#xff0c;影响因子为17.1。 结果解读#xff1a;
CRISPR-Cas9消耗H3.3K27M恢复了H3K27三甲基化#xff0c;并延…今天给同学们分享一篇实验文章“Antisense oligonucleotide therapy for H3.3K27M diffuse midline glioma”这篇文章发表在Sci Transl Med期刊上影响因子为17.1。 结果解读
CRISPR-Cas9消耗H3.3K27M恢复了H3K27三甲基化并延缓了患者来源的神经球和原位异种移植物的生长
作为对本研究中使用的模型中完全基因敲除H3-3A的生物学后果的控制作者首先使用CRISPR-Cas9和sgRNA靶向突变和野生型等位基因但不影响编码相同蛋白质的H3-3B在两个DIPG患者细胞系SU-DIPG-XIII和XVII中9。K27M突变对H3K27me3总量的显性负效应已有充分的文献证明1-4。在携带H3-3A杂合突变的两个患者细胞系中H3.3K27M敲除恢复了抑制性的H3K27me3三甲基化标记并减少了通过免疫印迹检测到的允许性的H3K27ac乙酰化标记。转导gRNA抗性H3-3A cDNA降低了恢复的H3K27me3标记与靶向效应一致。敲除恢复了H2K27me3三甲基化并减少了细胞增殖通过免疫荧光、EdU染色以及软琼脂集落形成进行检测。为了确定H3.3K27M在体内需要用于肿瘤维持作者在免疫缺陷的非肥胖糖尿病、严重联合免疫缺陷病、伽玛NSG小鼠的出生后第3天P3进行了患者细胞或H3-3A K27M 基因敲除细胞的原位移植9。作者选择了SU-DIPG-XIII系列进行此实验因为其较慢的增殖速率扩大了作者治疗的窗口期。移植的敲除细胞显示出延迟的肿瘤潜伏期导致显著增加的生存率P 0.039。与正常相邻组织相比H3.3K27M异种移植瘤在组织学上与患者肿瘤相似H3K27me3标记全局减少。这种效应在敲除瘤中得到缓解并与成熟神经元标记物神经核抗原NeuN和星形胶质纤维酸性蛋白GFAP的表达升高相关通过免疫荧光检测到这表明敲除细胞在体内增殖较少且更倾向于分化的谱系。这些结果证实并扩展了先前的研究5, 6并强调了突变H3的潜力。3K27M作为治疗靶点。 Gapmer ASO筛选以减少突变的H3-3A mRNA和H3.3K27M蛋白质
为了在DIPG患者细胞中药理学地靶向H3-3A mRNA作者探索了ASOs的潜力。作者设计并测试了带有2-O-甲氧基乙基MOE翼和磷酸硫酸酯PS骨架的gapmer ASOs。这些gapmer ASOs具有类似DNA的中央区域通过内源性RNase H引导对互补mRNA或前mRNA靶点的剪切并具有化学修饰的翼促进更紧密的RNA结合增强稳定性和改善细胞摄取12。首先为了尝试实现靶向等位基因特异性沉默作者设计了10个交集的20-mer PS-MOE-ASOs#1-10跨越H3-3A外显子2的突变位点和相邻核苷酸突变位点位于ASO间隙上。这些序列与H3-3A K27M 等位基因完全互补并与H3-3A WT 等位基因有一个错配。其次为了实现靶向基因特异性沉默-考虑到野生型H3.3蛋白仍然由H3-3B基因表达-作者设计了另外五个交集的20-mer PS-MOE gapmer ASOs#11-15以靶向外显子2突变位点上游或下游的外显子区域。这些ASO仅设计用于靶向H3-3A转录本而不是H3-3B转录本或者编码H3.1或H3.2经典组蛋白蛋白质的其他基因转录本。此外作者通过克隆包含外显子1至3、完整内含子1和2的基因组片段生成了一个野生型H3-3A迷你基因和一个带有A到T突变的突变型H3-3A迷你基因。
为了测试这些ASOs是否介导RNase-H1对H3-3A K27M mRNA的剪切或者对突变型和野生型H3-3A都起作用作者将单个ASOs100 nM与H3-3A WT 或H3-3A K27M 小基因共转染到HeLa细胞中。作者还通过自由摄取4 μM将这些ASOs传递到患者来源的神经球培养中。后一种方法依赖于受体介导的内吞作用并且需要更高浓度的ASO12。作者的初步小基因筛选确定了三个连续的具有等位基因特异设计的ASOsASO4、5和6以及两个连续的具有基因特异设计的ASOsASO12和13它们实现了H3-3A的强效沉默图1A。所有等位基因特异的ASOs在患者来源的细胞中对突变型等位基因的沉默效果更强而在这个浓度下ASO4、5和6在小基因环境中都能强效沉默两个等位基因。同样通过自由摄取传递到神经球培养中的ASOs将内源性突变等位基因的表达降低了50-70%而野生型等位基因的表达降低程度较小30-40%图1B。出乎意料的是一种基因特异性的ASOASO15也促进了等位基因特异性的沉默这表明了在其靶区域内结合的可能的调控性RNA结合蛋白的立体阻断图1B。 ASO介导的H3.3K27M消减延迟了神经球的生长并改变了细胞形态。
使用多个H3.3K27M DIPG患者衍生的细胞系作为神经球培养作者观察到与乱序对照ASO相比主导的ASOASO1和5明显延缓了肿瘤细胞的生长。作者观察到使用4μM ASO1或ASO5处理的SU-DIPG-XIII、SU-DIPG-XXXV和SU-DIPG-L神经球的增殖明显减慢P 0.001图2A、B和C。相比之下对于对照的H3.3WT胶质瘤细胞系乱序对照ASO和ASO5对增殖没有可测量的影响。在第5天时点这三个DIPG患者衍生的细胞系的细胞形态发生了变化观察到了类似神经突起的过程图2D。这种形态学变化与作者在CRISPR敲除正位移植模型中观察到的分化表型一致。此外使用主导的ASOs处理的SU-DIPG-XIII和SU-DIPG-L细胞系形成了较小的神经球图2E。 ICV注射铅ASO促进了H3.3K27M的消耗在RCAS-Tva小鼠模型中降低了肿瘤级别和促进了分化
为了在体内测试作者的引导ASOs作者首先采用了RCAS-Tva系统建立了小鼠DIPG模型。RCAS即具有剪接受体的复制能力的鸟肉瘤-白血病病毒长末端重复序列LTR是一种只感染表达鸟Tva逆转录病毒受体的细胞的病毒载体13。此系统先前被用于显示小鼠组蛋白H3.3K27M或H3.1K27M加速胶质瘤发生与另一个遗传小鼠模型的结果一致14-16。作者通过引入人H3-3A cDNA来改进该系统其转录物可以被作者的人类特异性ASOs靶向。作者将产生编码P1噬菌体Cre重组酶、人H3.3K27M、小鼠血小板源性生长因子BPDGFB和萤火虫荧光素的鸡DF1细胞输送到由小鼠Nestin启动子驱动的带有Tva和转化相关蛋白53Trp53-floxed等位基因的新生小鼠的脑干中图3A。小鼠在3-6周内发展出高级别的胶质瘤局部位于中线区域。通过组织学分析作者发现FLAG标记的H3.3K27M存在于胶质瘤病变中。大约90%的H3.3K27M肿瘤显示全局H3K27me3减少与正常相邻组织相比呈现出与患者肿瘤组织学相似的模式。肿瘤细胞也呈阳性染色表达寡突胶质细胞谱系标记物寡突胶质细胞转录因子2OLIG215。 为了测试体内引物ASO的有效性作者进行了立体定向ICV注射将其直接输送到脑脊液中CSF17, 18。作者在肿瘤发生时通过生物发光成像图3A检测到的时间点向侧脑室注射了一次性剂量500 μg的引物ASO5或CTRL ASO溶于盐水中。作者在预设的时间点从肿瘤或正常相邻组织中提取RNA和蛋白质。ASO5显著P 0.001降低了人类H3-3A K27M mRNA和FLAG标签的表达对内源性小鼠野生型H3f3a的影响较小但对H3f3b没有影响图3B。在蛋白质水平上ASO5显著P 0.001降低了人类FLAG标记的H3.3K27M并增加了H3K27me3的丰度图3C。作者进一步观察到FLAG标记的免疫荧光染色的消失即在约80%的处理细胞中FLAG信号低于检测水平。
接受对照ASO处理的小鼠发展出高度增殖和侵袭性的胶质瘤伴有大量有丝分裂图像、广泛的血管增生、偶尔的坏死以及坏死区周围的伪假性帕拉赛德。这些肿瘤没有包膜边界不清晰在肿瘤-脑界面处有一些肿瘤侵袭。相比之下接受ASO5处理的小鼠显示出肿瘤生长的潜伏期延长肿瘤呈现出延长的形态图3D。在这些肿瘤病变中有丝分裂图像很少坏死并不明显。此外ASO5处理的肿瘤病变中的细胞形态学上类似于胶质细胞和成熟神经元。作者得出结论体内由引导ASO引起的突变H3-3A的沉默导致了低级别肿瘤形成和更多分化的外观。
为了进一步描述组织学观察到的表型作者对已知分化标记物进行了免疫荧光染色。在具有相同遗传背景但携带H3.3WT肿瘤的小鼠中作者检测到成熟星形胶质细胞GFAP19、神经元NeuN20和少突胶质细胞髓鞘碱性蛋白MBP21的标记物表明H3.3WT胶质瘤中发生了神经发生和胶质发生图4A。相比之下在存在H3.3K27M的肿瘤病灶中检测到的GFAP、NeuN和MBP细胞较少图4B顶部面板。经过一次脑室内注射ASO5剂量后作者检测到大量的GFAP、NeuN和MBP细胞与Ki67标记的增殖细胞数量减少相一致Ki67是一个在细胞周期的所有活跃阶段表达的核细胞增殖相关抗原图4B底部面板。Ki67的减少和GFAP、NeuN标记的增加在统计学上具有显著性P 0.002或0.003图4C和D。作者通过对从正常相邻组织和肿瘤病灶中提取的总蛋白进行免疫印迹验证了这些结果图4E。作者得出结论H3.33K27M阻碍了星形胶质细胞和神经元的分化而ASO介导的H3.3K27M消耗恢复了分化程序。 ICV注射ASO5降低了NESTIN细胞群体并延长了肿瘤生长的潜伏期
DMG在特定的时空背景下出现并在中童期发生发病高峰年龄为6至9岁。细胞起源和微环境对肿瘤生长至关重要26, 27。先前的回顾性克隆分析显示NESTIN nbsp;细胞在人类中脑、脑桥和延髓中富集贯穿整个童年期且在腹侧脑桥处密度最高因此NESTIN nbsp;细胞群体与DIPG的时空发病率完全一致27。在作者的小鼠模型中相对于正常相邻脑组织NESTIN nbsp;细胞在肿瘤病变部位富集。经过ASO5治疗后NESTIN nbsp;细胞群体明显减少与GFAP nbsp;细胞数量的增加呈负相关图4F。此外ASO5治疗的小鼠的存活时间显著延长P 0.0001与对照组ASO治疗的小鼠相比图4G。这些结果表明H3.3K27M肿瘤起源于神经干细胞NESTIN nbsp;并与TRP53缺失和PDGF信号传导相关。
ASO5治疗在RCAS-Tva模型中产生的分化细胞是肿瘤起源的。
为了确定ASO5处理后出现的分化细胞是否来自肿瘤而不是小鼠细胞被招募到损伤部位作者利用在RCAS-Tva模型中表达的血凝素HA标记的Pdgfb和Cre cDNAs。作者使用HA抗体进行免疫荧光染色并观察到大部分肿瘤细胞都是HA nbsp;。当作者用HA和各个分化标记物双标记细胞时作者观察到大量的HA nbsp;星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞图5A。 ICV注射ASO5促进了星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的分化并减少了DIPG患者源自移植模型的肿瘤增殖
为了确认和扩展上述观察结果作者还在一个原位异种移植小鼠模型中测试了ASO5如9所述使用图3中显示的SU-DIPG患者系列之一。作者将10个表达荧光素的SU-DIPG-XIII细胞注射到P3免疫缺陷的NSG小鼠的第4脑室中并使用生物发光成像来跟踪肿瘤发生。由于这些免疫缺陷小鼠无法耐受RCAS-Tva模型中使用的高浓度ASO作者对其进行了单次脑室注射注射200μg对照ASO或ASO5图6A。与对照ASO处理组相比ASO5处理组的小鼠存活时间显著延长P 0.03图6B。与RCAS-Tva小鼠模型类似ASO5显著P 0.001P 0.016降低了人类H3-3A mRNA和总人类H3-3A mRNA的表达但不影响内源性小鼠野生型H3f3a或H3f3b图6C。此外ASO5降低了人类H3.3K27M蛋白的表达并增加了H3K27me3修饰的程度。ASO5处理还导致Luciferase标记的SU-DIPG-XIII细胞系中GFAP、NeuN和MBP蛋白的丰度升高图6D。ASO5处理的小鼠在肿瘤病灶中表现出不同的表型GFAP nbsp;NeuN nbsp;和MBP nbsp;细胞增殖较少Ki67 nbsp;而在对照组ASO处理的小鼠中神经发生和胶质发生受到损害大部分肿瘤细胞仍处于增殖状态图6E。与RCAS-Tva模型类似表达各种分化标记的细胞也具有H3K27me3 nbsp;。 总结
总之作者开发了在体外和体内直接靶向癌组蛋白mRNA的gappmer ASOs。前导ASO有效降解H3-3AK27M mRNA减少患者来源细胞和小鼠模型中的H3.3K27M蛋白。H3.3K27M蛋白丰度的降低导致小鼠模型中神经发生和胶质发生的恢复肿瘤生长的潜伏期延长存活率增加。药物干预的效果不如预期的完全基因敲除因为ASO治疗减少但不会消除突变蛋白的表达。此外与植入前基因敲除不同治疗性ASO是在肿瘤发作后给药的这代表了一种更现实的临床情况。作者预计最大的临床疗效可能需要联合治疗包括ASO给药例如放疗36或CAR-T细胞免疫疗法3738。
