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友情提示#xff1a;由于表格的存在#xff0c;用电脑看本推文#xff0c;效果更好 紫外吸收法 较为灵…大家好最近实验室的BCA仪器坏了偶然发现nanodrop也可以测蛋白浓度省不少时间本方法原理是紫外吸收
友情提示由于表格的存在用电脑看本推文效果更好 紫外吸收法 较为灵敏50100mg 快速 510分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测核酸的吸收可以校正 选择A280波长,测蛋白浓度 准备工作区域确保工作台面干净并清洁使用的移液器和试管。 使用纯水或缓冲液而不是待测的蛋白质样品进行blank校准。将一小量纯水或缓冲液与待测样品相同的体积放置到NanoDrop测量盖片上。 使用无菌纸巾轻轻擦拭测量盖片以去除表面的杂质。 将测量盖片放置到NanoDrop仪器的测量槽中并关闭仪器盖子。 在仪器软件中选择蛋白质浓度的测量模式。 点击测量按钮开始进行blank校准并等待一段时间直到校准完成。 校准完成后移除blank样品并清洁测量盖片。 取一小量待测的蛋白质样品通常约为1-2微升并将其转移到新的NanoDrop测量盖片上。 使用无菌纸巾轻轻擦拭测量盖片以去除表面的杂质。 将测量盖片放置到NanoDrop仪器的测量槽中并关闭仪器盖子。 点击测量按钮开始测量并等待一段时间直到测量完成。 读取测量结果包括吸光度值和蛋白质浓度。通常吸光度值在280纳米波长处进行测量该波长对应着蛋白质的最大吸收峰。
如果想更准确一些可以加上自己的标品测一遍标品的浓度制作标曲。 附
五种蛋白质测定方法比较如下
方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法Kjedahl法灵敏度低适用于0.2~ 1.0mg氮误差为 ±2费时 810小时将蛋白氮转化为氨用酸吸收后滴定非蛋白氮可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离用于标准蛋白质含量的准确测定干扰少费时太长双缩脲法Biuret法灵敏度低120mg中速 20~30分钟多肽键碱性Cu2®紫色络合物硫酸铵Tris缓冲液某些氨基酸用于快速测定但不太灵敏不同蛋白质显色相似BCA鳌合Cu作为显色剂产生蓝紫色并在562nm有吸收峰紫外吸收法较为灵敏50100mg快速 510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶各种核苷酸用于层析柱流出液的检测核酸的吸收可以校正Folin酚试剂法Lowry法灵敏度高5mg慢速 4060分钟双缩脲反应磷钼酸磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵Tris缓冲液甘氨酸各种硫醇耗费时间长操作要严格计时颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高15mg快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液TritonX-100;SDS最好的方法干扰物质少颜色稳定颜色深浅随不同蛋白质变化
