做微信小程序是不是不用做网站,什么是seo如何进行seo,创业网站模板,宝丰县精神文明建设的门户网站在CRISPR/Cas9基因组编辑实验中#xff0c;如果你已经构建好了gRNA表达载体#xff0c;并利用Cas9将它引入了目标细胞#xff0c;那么恭喜你#xff01;成功就在眼前#xff0c;指日可待。下一步#xff0c;你还要验证一下#xff0c;看看细胞的编辑是否如你所愿。在此如果你已经构建好了gRNA表达载体并利用Cas9将它引入了目标细胞那么恭喜你成功就在眼前指日可待。下一步你还要验证一下看看细胞的编辑是否如你所愿。在此一些专家给你提了一些建议。验证的方法将因物种和编辑类型而异。在这里我们主要关注二倍体的哺乳动物细胞不过许多原理也同样适用于其他的模式生物。在细胞中引入Cas9和gRNA将带来混合的细胞群体。双链断裂DSB产生之后细胞内的修复机制通过非同源末端连接NHEJ或同源定向修复HDR来起作用。哺乳动物细胞的修复以NHEJ为主这就带来了插入缺失的错误。不过引入的插入缺失存在异质性而等位基因编辑的频率也有所不同。有的细胞没有被编辑有的只有一个等位基因被编辑而有的则有两个。同源定向修复则需要修复模板的存在。验证过程的第一步是快速评估是否有一定量的细胞被编辑。对于插入缺失而言可通过错配切割分析来观察。对于HDR往往可通过限制图谱的改变或报告基因的读数来观察。对于缺失你可以通过特殊设计的PCR引物来判断。一旦你知道有一部分细胞经过了编辑那么你可以继续创建克隆细胞系。利用连续稀释来分离单个细胞接着进行扩增产生细胞系。如果你的质粒上有荧光蛋白的标记那么可通过FACS来富集含有Cas9和gRNA的细胞。扩增后分析每个细胞系并测序目的区域以验证编辑是否如你所愿。如果可能你还可以开展western blot。错配切割分析错配切割分析是一种快速而简单的插入缺失检测方法。此过程中通常使用Surveyor核酸酶因为它切割DNA双链3’端的任何错配。它能够检测多达12个核苷酸的插入缺失对频率低至1/32的突变敏感。此分析通常包含四个步骤1. PCR扩增目标区域2. 变性并再次杂交让突变型和野生型的链退火3. 用Surveyor核酸酶处理退火的DNA以切割异源双链4. 琼脂糖凝胶电泳分析DNA。在这个例子中两个gRNA的泳道都包含了预期大小的片段表明gRNA成功产生了插入缺失。这种分析通常是半定量的你可以看出gRNA1似乎比gRNA2更有效。图片来自Addgene检测同源定向修复如果你希望利用HDR来实现突变那么你最好先确定gRNA是否能高效切开你的目标序列。这可以参考上面的错配切割分析。一旦你选择了最佳的gRNA就可以引入它和Cas9以及你的修复模板。在设计你的HDR修复模板时事先要计划好整合事件的检测。举个例子你需要有目的地引入或删除限制性酶切位点这会改变PCR产物的酶切。或者你加入一个报告元件以便在DNA、RNA或蛋白水平检测HDR。如果整合了大的插入或缺失那么也可通过PCR产物的大小变化来检测。如果单核苷酸的变化引入或删除了限制性酶切位点那么可通过酶切来快速判断。否则只能通过Sanger测序、新一代测序或数字PCR来检测。HDR事件的频率往往不及插入缺失因此你可能需要筛选比较多的克隆。这个具体数量要取决于你的转染效率和HDR频率。如果你的转染效率是40%而HDR频率是5%那么2%的细胞将产生重组区域。因此你至少要筛选50个克隆。如果你能够利用标记选择出成功转染的细胞那么筛选的数量就能大大减少。通过PCR来检测缺失大多数的缺失是利用两个gRNA来创建的它们指导Cas9来切割DNA的中间区域。因此缺失可以通过PCR来检测扩增时使用在缺失区域两侧的引物。在这个例子中我们可以看出克隆1、5和7是缺失的杂合子而克隆4是缺失的纯合子。新一代测序也是个选择当然如果你的实验室有资源你也能利用新一代测序NGS来定量评估基因组编辑。当你有大量的样品或希望同时检测脱靶效应那么NGS是个好的选择。在使用这种方法时你需要有一组对照细胞这样你才能比较编辑前和编辑后样品的测序读取。CRISPResso等软件能帮助你开展数据分析。值得一提的是这篇文章中的方法并不是只针对CRISPR的同样适用于TALEN或锌指核酸酶的编辑。无论你采用什么方法验证编辑的时间都是值得花的。磨刀不误砍柴工分子生物学、细胞生物学、免疫学论文基金申请写作SCI润色。可私信沟通或V.X联系potterlee信诺金达专业服务加速您的实验进程。关于信诺金达 北京信诺金达生物科技有限公司Sinogene Biotech co., Ltd.位于北京中关村创业园区由留美归国人员2010创办是一家致力于生命科学技术开发、技术服务和生命科学试剂盒销售的生物学领域的高科技企业。 公司拥有专业的技术开发、技术服务团队具有专业的实验室和一流的设备。信诺金达技术服务部拥有分子生物学免疫学检测蛋白表达纯化及生物信息学四大平台。其中在real-time PCRWB植物miRNARNAi载体构建等方面具有专利技术为您提供高效、专业服务
